13、為何出現(xiàn)鬼峰
①進(jìn)樣閥殘余峰－－每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗；
②樣品中未知物－－處理樣品；
③柱未平衡－－重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑（尤其是離子對(duì)色譜）；
④三氟乙酸（TFA）氧化－－每天新配,用抗氧化劑；
⑤水污染（反相）－－通過(guò)變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用HPLC級(jí)的水。
14、為何出現(xiàn)峰拖尾
①柱超載－－降低樣品量，增加柱直徑采用較高容量的固定相；
②峰干擾－－清潔樣品，調(diào)整流動(dòng)相；
③硅羥基作用－－加三乙胺，用堿致鈍化柱，增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相pH值，純化樣品；
④柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效－－更換燒結(jié)不銹鋼，加在線過(guò)濾器，過(guò)濾樣品；
⑤柱塌陷或形成短路通道－－更換色譜柱，采用較弱腐蝕性條件；
⑥死體積或柱外體積過(guò)大－－連接點(diǎn)降至最低，對(duì)所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整，盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管；
⑦柱效下降－－用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護(hù)柱。
15、除了流速外，還有哪些因素能引起壓力改變
改變流動(dòng)相組成和溫度；改變柱長(zhǎng)、柱內(nèi)徑和填料粒度；柱突然阻塞壓力升高（正常情況下其它條件不變柱壓都是逐漸升高的）。
16、什么是強(qiáng)溶劑、弱溶劑
改變流動(dòng)相的組成或溶劑溶劑強(qiáng)度就可以改變峰容量因子和保留時(shí)間。在一定條件下，減少保留時(shí)間或縮短分析時(shí)間的溶劑為強(qiáng)溶劑，增加保留時(shí)間或延長(zhǎng)分析時(shí)間的溶劑為弱溶劑。
17、怎樣才會(huì)使峰位發(fā)生重排
在分析多組分樣品時(shí)，僅改變流動(dòng)相的強(qiáng)度（組成百分比）而不改變其組成，一般僅僅改變所有組分的保留時(shí)間，不會(huì)發(fā)生峰位的重排。
下列條件改變可能發(fā)生峰位重排：流動(dòng)相中換了強(qiáng)溶劑；pH值的改變；柱填料的改變；柱溫的改變；流動(dòng)相的組成改變（如，加入離子對(duì)試劑三乙基胺等）。
18、除了在線脫氣，常用的實(shí)驗(yàn)室脫氣方式還有哪些
加熱回流脫氣，脫氣效果最佳，但無(wú)法保持；氦脫氣，此方法脫氣效果佳，能除去百分之九十以上的空氣，但氦氣價(jià)格太貴，所以用的不多；真空脫氣，效果僅次于氦脫氣，但脫氣過(guò)程中容易造成樣品溶液揮發(fā)損失；超聲脫氣，只能脫去約百分之三十的空氣，但在實(shí)驗(yàn)室中最常用。目前還是盡量爭(zhēng)取用在線脫氣，方便且效果好。
19、評(píng)價(jià)一個(gè)色譜柱的最基本指標(biāo)有那些
評(píng)價(jià)一根色譜柱的基本指標(biāo)是：塔板數(shù)、峰不對(duì)稱因子、柱壓降、適用范圍和鍵合相濃度以及峰容量。
20、為何出現(xiàn)峰展寬
①樣品體積過(guò)大－－用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15% ；
②在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展－－進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散 ；
③數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢－－設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點(diǎn) ；
④檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)過(guò)大－－設(shè)定時(shí)間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10% ；
⑤流動(dòng)相粘度過(guò)高－－增加柱溫,采用低粘度流動(dòng)相；
⑥檢測(cè)池體積過(guò)大－－用小體積池,卸下熱交換器；
⑦保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)－－等度洗脫時(shí)增加強(qiáng)溶劑含量,也可用梯度洗脫；
⑧柱外體積過(guò)大－－將連接管徑和連接管長(zhǎng)度降至最??；
⑨樣品過(guò)載－－進(jìn)小濃度小體積樣品。
21、色譜雙峰產(chǎn)生的可能及判斷和處理
HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時(shí)間較短的條件下（不包括梯度），峰型應(yīng)對(duì)稱而尖銳。但是，在對(duì)樣品了解程度不夠，方法不妥，樣品處理方法及進(jìn)樣方式不合理下，會(huì)出現(xiàn)各種意想不到的問(wèn)題，而對(duì)色譜峰難以作出合理的解釋?zhuān)绕鋵?duì)于新手更是如此。色譜雙峰指的是明是一種物質(zhì)，但在色譜圖中出現(xiàn)雙峰，而表明含二種物質(zhì)。出現(xiàn)這種情況分為四種原因。
1)色譜柱
如果你分析樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)每個(gè)色譜峰都雙峰出現(xiàn)（出峰越快，雙峰的可能性會(huì)減少），尤其采用單一純物質(zhì)時(shí)，可以肯定色譜柱出問(wèn)題－柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。如果進(jìn)樣量少，原來(lái)色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應(yīng)是柱頭受堵，將色譜柱反過(guò)來(lái)接，用流動(dòng)相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過(guò)來(lái)，一般情況下就行了。當(dāng)然不反沖，正沖有時(shí)也會(huì)正常的。如果峰拖尾，雙峰強(qiáng)弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，這是可以將進(jìn)樣那頭擰開(kāi)，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過(guò)這種活，需要一定技術(shù)，同時(shí)不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會(huì)應(yīng)柱效很低而報(bào)廢。
2)溶劑極性及進(jìn)樣量
許多HPLC分析者對(duì)此可能不以為然，一般的 HPLC的書(shū)籍和文獻(xiàn)都不會(huì)提到這方面的內(nèi)容，而這確是雙峰產(chǎn)生的一個(gè)很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜，流動(dòng)相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動(dòng)相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動(dòng)相溶解，但是很多情況是不一致的。當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進(jìn)樣量大，如定量管為20ul，此條件下完全可以肯定，單一的純物質(zhì)出雙峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一樣），且拖尾，保留時(shí)間會(huì)提前（相對(duì)進(jìn)樣量少而言），將進(jìn)樣量減少一半以上，峰型將變?yōu)檎?。這是樣品的溶劑與流動(dòng)相極性相差太大，而流動(dòng)相來(lái)不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的。上面提到進(jìn)樣量造成雙峰的一個(gè)原因，另一個(gè)原因是，進(jìn)樣量不一定大，但絕對(duì)量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色譜柱問(wèn)題）。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了，這是由于進(jìn)樣量過(guò)大，色譜柱過(guò)載造成的。
3)樣品的特性
有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，而這種互變異構(gòu)體無(wú)法分開(kāi)，而是以一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡存在。在色譜分析時(shí)，在一個(gè)特定的條件下，一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現(xiàn)象將消失，如，紅霉素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC-MS下，用質(zhì)譜檢測(cè)器，其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯，例如，我分析過(guò)的農(nóng)藥啶蟲(chóng)瞇（吡蟲(chóng)清）。
4)參數(shù)
記錄的參數(shù)一般都內(nèi)定的，不必修改，但GC和HPLC的參數(shù)是不完全一致的，例如，C－R3A數(shù)據(jù)記錄儀上的一般記錄時(shí)間間隔GC為2ms，HPLC為5ms，如果記錄間隔時(shí)間縮短，一個(gè)峰將變?yōu)槎€(gè)峰或更多。
22、為什么在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)倒峰
所用的流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下有吸收，而進(jìn)在此波長(zhǎng)下沒(méi)有吸收或吸收低于流動(dòng)相的溶液，在流動(dòng)相中會(huì)出現(xiàn)洞穴，通過(guò)柱后出現(xiàn)倒峰。
23、為何會(huì)出現(xiàn)“胖”峰和平頭峰，怎樣避免
用比流動(dòng)相強(qiáng)度大的大體積樣品進(jìn)樣，通常會(huì)損害色譜圖的質(zhì)量，而出現(xiàn)“胖”峰和平頭峰。應(yīng)遵循下列規(guī)則選用溶劑溶解樣品：A最好用流動(dòng)相溶解樣品進(jìn)樣。B用大體積弱溶劑溶解樣品，如反相色譜中用水溶解樣品進(jìn)樣，主要缺點(diǎn)是每次進(jìn)樣后在色譜圖的開(kāi)頭出現(xiàn)大的負(fù)峰，有時(shí)還波及到樣品峰。C需要時(shí)用強(qiáng)溶劑溶解進(jìn)樣。
24、前延峰的發(fā)生及處理
因柱溫問(wèn)題很易引起前延峰，有些樣品在常溫下分離可見(jiàn)前延峰，提高溫度后前延峰的現(xiàn)象消失。在離子對(duì)色譜中，前延峰的另一個(gè)原因是用非流動(dòng)相作樣品溶劑。因此在離子對(duì)色譜中要求僅用流動(dòng)相溶解樣品，而且進(jìn)樣量不要太大，否則會(huì)導(dǎo)致前延峰或其它問(wèn)題。在RP-HPLC中樣品溶液的強(qiáng)度大于流動(dòng)相引起前延峰。增加流動(dòng)相的強(qiáng)度，減少樣品溶液的強(qiáng)度，在離子對(duì)色譜中增加離子強(qiáng)度，可以克服前延峰的效應(yīng)。此外使用流動(dòng)相溶解樣品是解決的最簡(jiǎn)單實(shí)用的方法。
25、如何簡(jiǎn)單判斷比例閥是否內(nèi)漏
設(shè)定泵使用一個(gè)單獨(dú)通路（A），打開(kāi)Purge閥，流速5mL/min，提起其他溶劑瓶?jī)?nèi)的溶劑過(guò)濾頭直至離開(kāi)液面，觀察這些通路（B、C、D）內(nèi)的溶劑是否隨著流動(dòng)，正常時(shí)均不應(yīng)流動(dòng)。
26、峰變寬的原因
A在使用過(guò)程中柱本身退化，逐漸降低柱效。
B柱外峰寬效應(yīng)。一根很好的專(zhuān)用柱用于另一液相色譜系統(tǒng)引起塔板數(shù)降低，說(shuō)明新系統(tǒng)有很大的柱外峰寬效應(yīng)。
C化學(xué)效應(yīng)，多數(shù)是流動(dòng)相和固定相相互作用所致，改變流動(dòng)相可使寬峰有所改善。
27、柱平衡慢的常見(jiàn)原因
柱平衡慢的常見(jiàn)原因是，組分在舊的或新的流動(dòng)相中對(duì)柱吸附強(qiáng)，或者在新的流動(dòng)相中濃度小甚至為零。A流動(dòng)相含有胺改良劑；B流動(dòng)相含有離子對(duì)試劑；硅膠柱；流動(dòng)相中有四氫呋喃?？煽紤]采用專(zhuān)用柱用于特殊的方法，不用時(shí)將柱折下來(lái)，注滿適當(dāng)?shù)娜軇┗蛄鲃?dòng)相，密封保管，不再作其它的分析。
28、對(duì)內(nèi)標(biāo)物的要求有哪些
A.內(nèi)標(biāo)物的結(jié)構(gòu)或理化性質(zhì)應(yīng)與被分析組分相似或相近；
B.內(nèi)標(biāo)物的保留值應(yīng)稍大于或小于被分析物的保留，不能相差過(guò)大；
C.內(nèi)標(biāo)物的峰要與所有被分析物的峰有良好的分離度（R大于1.5），不能讓內(nèi)標(biāo)物成了干擾物；
D.無(wú)結(jié)構(gòu)相似的內(nèi)標(biāo)物，可用保留相近的內(nèi)標(biāo)物；E儀器對(duì)分析物的響應(yīng)與內(nèi)標(biāo)基本一致，出峰面積大小不能相差懸殊。
29、什么是HPLC的“無(wú)限直徑效應(yīng)”
在HPLC分析中由于使用了高效微粒固定相及高壓流動(dòng)相，樣品以柱塞式注入色譜柱后，因柱的阻力大，樣品分子在柱中的分子擴(kuò)散很小，直至它從色譜柱流出也未與色譜柱內(nèi)壁接觸，因而引起的色譜峰形擴(kuò)展很小，能保持高柱效。
30、如何評(píng)價(jià)一臺(tái)檢測(cè)器
A.噪聲：通常噪聲是指由儀器的電氣元件、溫度波動(dòng)、電壓的線性脈沖以及其他非溶質(zhì)作用產(chǎn)生的高頻噪聲和基線的無(wú)規(guī)則波動(dòng)；
B.基線飄移：漂移是基線的一種向上或向下的緩慢移動(dòng)，可在較長(zhǎng)時(shí)間（0.5~1h）內(nèi)觀察到。它可掩蔽噪聲和小峰。漂移與整個(gè)液相色譜系統(tǒng)有關(guān)，而不僅是由檢測(cè)器引起的；
C.靈敏度（最小檢出濃度或最小檢出量）：在一個(gè)特定分離工作中，檢測(cè)器是否有足夠的靈敏度是十分重要的。當(dāng)比較檢測(cè)器時(shí)，常使用敏感度這一性能指標(biāo)。敏感度，即指信號(hào)與噪聲的比值（信噪比）等于2時(shí)，在單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測(cè)器的溶質(zhì)的濃度或質(zhì)量；
D.線性范圍：在進(jìn)行定量分析時(shí)，希望檢測(cè)器有寬的線性范圍，以便在一次分析中可同時(shí)對(duì)主要組分和痕量組分同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)；
E.檢測(cè)器的池體積：它應(yīng)小于最早流出的死時(shí)間色譜峰的洗脫體積的1/10，否則會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的柱外譜帶擴(kuò)展。
以上就是譜析色譜工程師對(duì)高效液相色譜儀HPLC 30個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題對(duì)策介紹，你是否對(duì)液相色譜儀使用有了新的啟發(fā)和思考？如還有疑惑和難點(diǎn)請(qǐng)致電公司色譜技術(shù)人員，亦可登錄公司網(wǎng)站http://www.jingdongliuliang.com在線咨詢工作人員，我們將一一為您解答。
